基因治疗重返舞台医疗大势所趋

来源：-6-30生命奥秘杂志

最近，多项有关基因治疗的临床试验数据都表明其具有显著的治疗效果，并具备卓越的安全性。长久以来，科学家们一直致力于找到相应的途径，采用基因疗法，以帮助身患绝症或者严重致残的患者重获健康，上述试验结果恰恰为此提供了数据支持。在这些进展背后，最重要的是载体设计技术的提高与革新，保证了将治疗性基因安全植入特定细胞内的安全性。此外，还有多种其它技术的发展，也对基因治疗的复兴起到了关键的作用：例如，基因剪接及修复遗传性基因突变；采用干细胞制备各类组织，促进机体有效启动强有力的免疫应答来对抗癌症等。

长期以来，由于基因疗法具有从根源上医治疾病的潜力，从而对科学家、临床医生乃至公众都有着格外的吸引力。基因疗法通过对抗细胞内功能失常的基因，或者直接将其替换而发挥治疗作用。尽管从理论上而言，其原理十分简单，但在真正实施的过程中所遇到的种种障碍，却让人十分气馁。事实上，基因转移过程中，必须越过细胞及组织内复杂的重重壁垒，才能将新的遗传信息成功导入目标细胞，启动具有治疗功能的分子表达，而不干扰基本调节机制。还要必须保证基因修复细胞具有足够多的数量，逃过免疫识别，并且可以长期存活，或者能够将其修复功能传递给后代细胞，才能起到治疗作用。在过去的二十年里，科学家们针对遗传性疾病、癌症及慢性感染进行了若干基因治疗的临床试验。其中，只有少数结果显示具有明确的临床疗效，而在其它一些试验中，患者出现了与载体相关的严重副作用。这些令人失望的结果，让人们对基因疗法产生了忧虑和怀疑的态度。但是，这种情况正在发生根本性的转变。最近，一批基因治疗I期和II期临床试验的结果表明，在治疗许多严重的血液、免疫、神经系统等遗传性疾病方面，基因治疗是具有显著的疗效和可靠的安全性的。这些疾病包括：原发性免疫缺陷疾病、脑白质营养不良、地中海贫血、血友病及视网膜营养不良性萎缩，此外包括B细胞恶性肿瘤等（表1）。在所有这些试验中，都采用了改进后的载体技术，将治疗性基因转移入细胞。在某些试验中，遗传物质在体外被转移到造血干细胞（HSC）或T淋巴细胞（Tcell）；而另一些试验则在体内将遗传物质靶向转移至肝脏内的肝细胞或视网膜上的感光细胞。本文将对相关性最高的临床结果进行综述，重点介绍基因转移技术领域内的新进展，及我们对与此相关的生物学过程的深层次的理解，并就基因治疗的挑战及前景进行讨论。

表1基因治疗临床试验一览表

所治疗疾病

所用载体及治疗策略

入组患者人数

随访

时间

（月）

患者状态以及临床和生物学结局

临床试验编号

以造血干细胞为基础的基因治疗

Wiskott–Aldrich综合症

慢病毒载体、CD34+细胞体外基因转移策略

7

10~60

所有患者皆存活，且状态良好。转基因细胞在体内非常稳定，临床获益相当稳定，且安全性良好。

NCT

Wiskott–Aldrich综合症

慢病毒载体、CD34+细胞体外基因转移策略

7

9~42

6名患者皆存活，且状态良好。1名患者死于之前就已经存在的感染，转基因细胞在体内非常稳定，临床获益相当稳定且安全性良好

NCT

NCT

NCT

X染色体连锁重度联合

免疫缺陷症

自我失活γ逆转录病毒载体、CD34+细胞体外基因转移策略

9

12~39

8名患者皆存活，且状态良好。1名患者死于感染，转基因细胞在体内非常稳定；7名患者临床获益相当稳定，且安全性良好；1名患者转基因细胞移植失败，转而接受造血干细胞移植治疗

NCT

NCT

NCT

重型β地中海贫血

慢病毒载体、CD34+细胞体外基因转移策略

3

24~72

2名患者转基因细胞在体内非常稳定。其中1名患者不再需要输血治疗；1名患者转基因细胞移植失败，需要输血治疗

不适用

重型β地中海贫血

慢病毒载体、CD34+

细胞体外基因转移策略

2

15

转基因细胞在体内非常稳定；2名

患者不再需要输血治疗，且治疗

安全性良好

NCT

重型β地中海贫血

慢病毒载体、CD34+

细胞体外基因转移策略

5

1~6

转基因细胞在体内非常稳定。其中2名最先接受疗效评估的患者不再需要输血治疗，且治疗安全性良好

NCT

肾上腺脑白质营养不良

慢病毒载体、CD34+细胞体外基因转移策略

4

54~

转基因细胞在体内非常稳定。其中3名患者获得稳定临床获益，且所有患者治疗安全性良好

不适用

异染性脑白质营养不良

慢病毒载体、CD34+细

胞体外基因转移策略

20

3~60

转基因细胞在体内非常稳定。所有在婴儿期末，尚未表现出临床症状时即接受治疗的患者均获得稳定临床获益，且所有患者治疗安全性良好

NCT

肝脏定向基因治疗

乙型血友病

AAV8载体，静脉输注

10

16~48

没有抑制剂，凝血因子IX持续表达，在给药（外源基因）剂量较高的6名患者中，平均凝血因子IX水平为5.1±1.7%

NCT

乙型血友病

AAV8载体，静脉输注

7

≤12

没有抑制剂，其中1名患者持续表达凝血因子IX

NCT

T细胞免疫疗法治疗肿瘤

B细胞淋巴瘤或慢性淋巴细

胞白血病

γ逆转录病毒载体、T

细胞体外基因转移策

略，嵌合抗原受体修饰

抗CD19细胞

15

1~23

其中8人完全起反应，4人部分起反应，总体起效率达到80%

NCT

B细胞急性淋巴细胞白血病

γ逆转录病毒载体、T

细胞体外基因转移策

略，嵌合抗原受体修饰

抗CD19细胞

5

1~4

5人均完全起反应，总体起效率达到%。其中4人根据临床试验设计随即接受造血干细胞移植；1人由于条件不适合，没有接受造血干细胞移植，病情复发

NCT

B细胞急性淋巴细胞白血病

慢病毒载体、T细胞体

外基因转移策略，嵌合

抗原受体修饰抗CD19

细胞

30

1~24（平均随访时

间为7个月）

其中27人完全起反应，总体起效率达到90%。19人病情得到缓解，其中有3人接受了造血干细胞移植；7人病情复发，其中有3人是在转基

因T细胞消失之后复发

NCT

NCT

B细胞急性淋巴细胞白血病

或淋巴瘤

γ逆转录病毒载体、T

细胞体外基因转移策

略，嵌合抗原受体修饰

抗CD19细胞

21

平均随访时间为10个

月。

其中14人完全起效（第28天时），总体起效率达到67%，10人接受造血干细胞移植，接受造血干细胞

移植平均时间为51天

NCT

视网膜基因治疗

2型伯氏先天性黑蒙

AAV2载体，单侧视网

膜下注射

5

36

所有5名患者视敏度均有稳定改善

NCT

2型伯氏先天性黑蒙

AAV2载体，单侧视网

膜下注射

3

54~72

所有3名患者在6个月时视敏度均有稳定改善，并且在1~3年内得到进一步改善，随后开始下降

NCT

2型伯氏先天性黑蒙

AAV2载体，单侧视网

膜下注射

12

36

6名患者视敏度均有稳定改善，最佳效果出现在治疗后6~12个月，随后开始下降

NCT

造血干细胞基因治疗

HSC一直以来都是体外基因治疗技术中的首选靶标。具有自我更新能力的多能干细胞HSC内的遗传修饰，可以保证在体内稳定地供给其基因已经得到矫正的后代细胞。这些细胞可以在成熟造血细胞系停止发育，或者出现功能障碍时，发挥纠错的功能。考虑到HSC的自我更新性质，以及必须确保遗传修饰被传递给它们的后代细胞，基因矫正必须采用载体介导的转基因插入技术，或者体内基因剪接技术引入到细胞内的染色质上。

已经进行的相关HSC基因治疗试验结果表明，某些疾病的患者可以从此类疗法中获益，证实基因疗法有发展潜力。但是，他们也指出，采用基于γ逆转录病毒（γ-RV）的早期载体，是有明显的局限性和风险的。比如说，这些技术在转导基因进入大部分原始祖细胞的过程中，只能发挥有限的作用，这就导致体内携带矫正基因的造血细胞的数目很少且持续时间短暂。在长期跟踪研究中发现，有些患者会出现原癌基因附近载体插入所导致的白血病。因此，在临床前期模型中，寻找发展具有更高疗效及安全性的载体，例如慢病毒载体，使人们重新把目光投向基因治疗。

采用新载体的HSC基因疗法，已经在多个遗传性疾病中进行了试验，这些疾病包括免疫系统疾病Wiskott–Aldrich综合症（WAS）、X连锁严重联合免疫缺陷病（SCID-X1）、血液病（β地中海贫血）、神经退行性疾病（肾上腺脑白质营养不良症及异染色体脑白质营养不良症）（表1）。患有SCID-X1的儿童，其免疫系统发育迟缓且功能受损，这是由于患儿体内缺少某些免疫细胞发育所必需的细胞因子受体。而那些WAS患者则缺少细胞骨架接头，无法组装免疫突触。患上述两种疾病的孩子，都非常容易发生感染，而WAS患儿还由于血小板数目减低，易出现大出血。重型β地中海贫血患者体内无法表达血红蛋白β链，从而导致有缺陷的红细胞生成，易发生溶血，进而导致严重贫血，需要频繁输血治疗及服用铁螯合剂。肾上腺脑白质营养不良症或异染色质脑白质营养不良症患儿在早期会出现髓鞘发育异常，累积中枢及外周神经系统的神经胶质及神经细胞随之退化。他们无法分解髓鞘质的某些代谢产物，对肾上腺脑白质营养不良症患者来说，这是因为过氧化物酶ATP结合级联转运因子出现缺陷造成的；至于异染色质脑白质营养不良症，则是因为溶酶体酶芳基硫酸酯酶A的缺陷所导致。此类患者的运动、感觉及认知功能会出现快速且不可逆转的退化，随后在数年内死亡。HSC移植中，HSC被从健康捐献者转移到患有某种疾病的接受者，基本可以使SCID-X1、WAS及β地中海贫血患者获得治愈。如果HSC移植在脑白质营养不良症发病之前，或者在刚刚开始发病时就实施，是可以终止疾病进展的。不过，相较而言，肾上腺脑白质营养不良症患者的治疗效果更加令人满意。异体HSC移植可能会有相当大的风险使接受移植者患病甚至死亡，尤其是当捐献方和接受方的人白细胞抗原（HLA）不匹配时。在极少数情况下，即使双方均是来自同一个家庭的成员，其HLA也相互匹配，患病风险仍然很高。HSC基因治疗可以解决上述问题，尤其是当无法寻找到相互匹配的HSC捐献方时。

在HSC基因治疗中，先在体外将基因转移至造血祖细胞内。首先，采用CD34表面标记物对细胞进行纯化，将其和来自患者骨髓或者流动的外周血的白细胞分开。接下来，将纯化所得细胞在生长刺激性细胞因子环境内培养2-4天，在此过程中，暴露于具有矫正转基因表达功能的载体。在接受矫正细胞转移至体内之前，患者应预先接受相应的化学药物治疗。如此可以减少骨髓内内源性祖细胞及分化细胞的数目，在某些情况下，还包括减少淋巴器官内上述细胞的数目，从而有利于来自体外的、携带矫正转基因细胞的成功植入。患者预先接受化学药物治疗，会导致相当比例的患者提早患病，这主要是由于暂时的血细胞数目减少、免疫缺陷及粘膜损伤等，提高了患者发生严重感染的风险。此外，化学药物治疗也可导致迟发的疾病，例如继发性肿瘤、不孕不育症等。已经有一些HSC基因治疗试验，致力于降低由于患者接受预先治疗所导致的患病率，研究者尝试通过降低用药剂量，以及联合用药的方式来解决这些问题。还有一些化疗药物，会减少患者中枢神经系统内小胶质细胞祖细胞的数目。对于接受了HSC基因治疗的脑白质营养不良症患者，上述细胞会被基因矫正细胞所取代，当基因矫正细胞到达中枢神经系统组织时，产生正常功能的后代细胞，会清除累积的髓鞘质代谢产物。在异染色质脑白质营养不良症患者体内，这些携带矫正基因的细胞也会释放功能性溶酶体酶对其它组织内细胞进行矫正。

所有采用慢病毒载体所进行的HSC基因治疗试验结果都表明，在大部分患者体内，都可见到稳定、高水平的造血细胞的再生。所有被检测的造血系细胞（单核细胞、巨噬细胞、红细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞和T细胞）都含有基因矫正细胞，并稳定地接受新形成的矫正细胞的输入——在寿命较短的髓系细胞内最为明显——可见，基因移植一定发生在可以自我更新、具有多潜能的祖细胞内，这些细胞有效地被移入患者体内。含有基因矫正细胞的造血细胞系统的重建情况，随患者和试验的不同而有所不同。这反映了疾病及其矫正对不同造血系细胞的不同影响，此外，载体批次不同，患者所接受的预先药物治疗等因素也会带来相应的影响。应该指出的是，大部分患者在成功接受了异体基因捐献者的HSC移植后可以获得超过想象的益处。这在异基因型脑白质营养不良症的临床试验中尤其突出。该试验的原理是，基因转移可以驱动造血细胞相较正常细胞有更高水平的溶酶体酶的表达，从而使这些细胞能够提供更多的酶类，进而影响组织。这一方法克服了HSC在治疗上述疾病时所遇到的困境，从而获得了令人较为满意的结果。尽管越来越多的患者参与到此类HSC基因治疗的试验中（表1），却还未见到有研究者报告与慢病毒载体相关的副作用。在最近的一项针对参与试验者的跟踪研究中发现，那些成功获得矫正细胞的患者，目前都处于良好的状况——也就是说，在接受治疗后，这些患者要么已经康复，要么症状有所缓解——几乎过着成常人的生活，其中首个接受此类治疗的患者，在大约七年前就参加了肾上腺脑白质营养不良症的临床试验。如果未曾接受基因治疗，这些患者可能已经死于该疾病了。

肝脏导向的基因治疗

肝脏一直以来都是体内基因治疗的首选靶标。作为主要内脏和体内的核心代谢器官，肝脏通过含有高通透性管壁的血窦结构接收大量的血供，这一结构有利于吸收来自血液的各类微粒，例如病毒等进入肝细胞。肝细胞寿命长，并且是高效的蛋白工厂，可以有效地将其“产品”释放到血液循环中去。因此，稳定地将转基因传递至肝脏，不失为一种有效策略，可用于治疗若干遗传性代谢疾病、血浆蛋白功能缺陷，尤其是那些与凝血因子有关的疾病。肝脏导向基因治疗的主要障碍是，向患者血液内注入病毒颗粒后，可能会由于严重的炎症反应而导致毒性；也有可能在患者血液内已经存在病毒特异性抗体，使注入的病毒颗粒失活；此外，病毒也可能被存在于肝脏和脾脏的巨噬细胞清除掉。如果体液或细胞免疫被转基因产物激活，那么，基因治疗的效果就会在血液循环中被遏制，矫正细胞也有可能会被细胞毒性T细胞杀死。

肝脏导向基因治疗主要被用于严重的B型血友病方面的研究，其中，通常采用来源于人的细小病毒和腺相关病毒（AAV）。经血管注射入体内后，部分AAV载体血清型可以有效靶向到达肝细胞，并与矫正细胞保持稳定的关联，大部分在细胞核内以非整合的游离体形式存在。在动物模型中，这种基因转移策略没有使机体启动针对转基因产物的免疫应答，相反，还建立了转基因特异性耐受。在非增殖性肝细胞内，包含凝血因子IX（FIX）的AAV载体基因组持续存在，可以保证正常功能的FIX向血液循环中稳定供应，FIX是一种在B型血友病患者体内缺失或存在缺陷的蛋白质。只要患者体内的FIX表达水平达到正常水平的1%，就足以将严重B型血友病转变成轻型。这种功能上的部分重建，有利于减少自发性出血的风险，因为出血对关节是不利的，如果发生在大脑，还可能致命。此外，上述治疗还可以减少通过静脉输入预防疾病因子替换性治疗的需要，这类输注治疗对于患者而言是一个巨大的经济负担，费用高昂，而且只有在卫生体系非常健全的发达国家才能获得。尽管早期的临床试验就报告了向血液内输注AAV载体的安全性，但其FIX表达十分有限且短暂。这可能是由于肝脏内基因转导的水平很低，也可能是持续存在于矫正性肝细胞内的AAV组分，启动了延迟的细胞内免疫应答，从而被消除。最近，有研究者采用了一种新的AAV血清型（AAV8），并且改进了蛋白表达策略，从而克服了上述局限性。结果显示，在单一一次耐受量好的外周静脉输注后，载体剂量依赖性FIX表达可以达到正常水平的6%。三年后，FIX表达在大部分患者体内依然稳定，尽管有些患者，在接受治疗后的4-8周内会出现肝细胞损伤，但可通过给予短暂的皮质激素类治疗来缓解。大部分接受治疗的患者，都可以减少或者不再需要预防疾病因子替换性治疗，生活质量得以大大提高。

T细胞免疫疗法治疗肿瘤

T细胞也是在体外基因治疗中首选的热门改造细胞。T细胞免疫疗法主要用于激活后天免疫反应，可以治疗肿瘤或HIV病毒感染等慢性感染性疾病。从患者的外周血中就能很容易地获得自体T细胞，并且在体外就能够进行培养和扩增。培养扩增以后用能够表达外源T细胞抗原受体（T-cellantigenreceptor,TCR）的γ逆转录病毒或慢病毒等载体转染进T细胞，完成基因改造，最后将改造好的T细胞再回输给患者，这些TCR就能够特异性识别肿瘤抗原或抗病毒分子了。之所以会选择T细胞作为改造目标是因为在用自体淋巴细胞回输技术对晚期黑色素瘤患者进行治疗时观察到了意义重大的、特定的肿瘤反应，这种肿瘤反应有时甚至会让肿瘤彻底消退。这种治疗作用可能与细胞在体外被激活和扩增有关，因为体内原本也存在少量肿瘤细胞特异性的细胞毒性T细胞，只不过被体内的微环境抑制住了。这些现象表明，后天免疫反应在肿瘤治疗中的应用潜力还是相当大的，只需要使其脱离抑制信号，并且回输大量的反应性T细胞就能够达到一个比较好的效应靶标比（effector–targetratio）。先用去淋巴细胞药物（lymphoid-depletingregimen）对患者进行预处理，然后再回输经改造的T细胞，这样也有助于提高T细胞的植入效率及活性。

将外源性TCR转移至T细胞就能够免掉在患者自身T细胞中寻找已经存在的肿瘤特异性T细胞的步骤，还可以好好利用人工合成技术，合成出高亲和力的TCR，而在体内必须经由胸腺的选择作用才能最终筛选出合格的TCR，决定自体细胞的免疫特异性。理想状态下，这种TCR会锁定自体蛋白中的肿瘤相关抗原，比如癌胚抗原或睾丸抗原等，正常组织此时不会表达，或者即便表达也检测不到自体蛋白。此外，它们还可以瞄准通常只见于某种特定肿瘤的致癌突变（“司机”突变），这些突变即便能够躲过免疫攻击，也是不会丧失的。不过最近的研究发现，大部分天然免疫反应或后天的、肿瘤特异性免疫反应针对的都是继发的“乘客”突变抗原，这种突变是肿瘤细胞内的随机突变不断积累而来的。因此，这种免疫疗法必须是高度个性化的治疗策略，既需要根据肿瘤的外显子组或蛋白质组信息来确定可能的“乘客”突变抗原，同时还需要利用专门的T细胞遗传工程学改造技术获得同源TCR识别序列。

有关T细胞免疫疗法治疗肿瘤的早期临床试验发现，虽然使用了针对肿瘤相关抗原的TCR，但也只针对部分肿瘤有反应，甚至在某些时候还会出现脱靶的现象，甚至导致组织损伤等严重的副作用。最近，研究人员又开始利用基因转移技术给T细胞导入人工合成的嵌合抗原受体（chimaericantigenreceptors,CAR）。CAR能够同时兼具肿瘤相关表面分子结合抗体的作用，以及一个或多个TCR和共刺激受体复合体（costimulatoryreceptor







































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