基因治疗与精准医学

引言

吴小兵教授应邀参加了年在深圳举办的中国生物制品年会暨第十五次全国生物制品学术研讨会，并做题为“罕见病基因治疗与精准医学”的报告。吴小兵教授将她的报告和PPT内容整理成文，与同行分享。

一、基因治疗的关键技术

如上图所示，基因治疗的核心技术是基因导入系统。基因导入系统由被导入的基因或基因序列、基因表达元件、载体被复制和包装所需的顺式作用元件、载体核酸的包裹材料以及给药方式和给药装置组成。其中的治疗基因包括编码蛋白的DNA、或者编码阻断基因表达的RNA的DNA。最近的基因编辑技术中，编码核酸酶（ZFN,TALEN，Cas9)的DNA以及编码靶点序列和引导序列RNA的DNA，也都可以纳入被载体导入的“治疗基因”范畴。

基因的表达系统则是那些使治疗基因得以正确和适当表达的基因调控元件，包括启动子、增强子、加尾信号和各种其它调控序列。随着基因组、蛋白组、转录组等组学的进展、生物信息学的应用以及分子生物学和生物技术的发展，越来越多的基因调控元件被发现和使用，科学家们甚至学会了自己拼装和创造调控元件。

接下来是基因载体元件和基因包装材料。前者对于病毒载体而言，是将基因包装到病毒颗粒中所需要的顺式作用元件，包括复制起点、包装信号等；对于非病毒载体而言，这一特点并不明显或不需要。后者是包裹于被转导的核酸外面的包装材料，对于病毒载体而言是病毒的外壳和/或外膜，对于非病毒载体则是一些高分子材料或干脆没有（裸DNA)。

最后，给药方式和和给药装置也成为基因导入系统的重要部分。不同的给药方式可以使治疗基因和元件靶向到机体内期望的部位并发挥作用。比如用AAV1或AAV6载体肌肉注射可在肌肉中持续高表达外源基因；用AAV8载体静脉注射可以达到肝脏持续高效表达外源基因的效果；用AAV2载体视网膜下注射可以高效转导RPE细胞；用AAV9载体静脉注射可望穿过血脑屏障使治疗基因达到神经系统。此外，用吸入方法可以将基因导入肺内，用肿瘤原位注射方式可以将基因导入肿瘤局部；用膀胱灌注的方法将基因导入膀胱粘膜；用脑定位注射方法将基因导入脑部核团或肿瘤。

对于血液病或免疫细胞或干细胞，由于目前还无法实现在体内定向导入，同时由于这些细胞比较好取出来就行体外操作，往往采取Exvivo转基因的方式转导这一类细胞。近年来研究得如火如荼的CART和各种免疫细胞转基因治疗、干细胞转基因治疗都属于这一类。

二、基因治疗针对的疾病对象

最初，基因治疗是针对基因缺陷引起的疾病、通过基因导入的方法，进行基因替代、补偿和纠正以达到纠正或补偿异常功能的目的。遗传病，尤其是单基因遗传病显然成为基因治疗的首选对象。然而，由于基因治疗的理念颠覆了传统的药物治疗，是一种全新的医学治疗模式，因此它一经产生，就被研究者们用到了除了遗传病之外的各种疾病，包括肿瘤、心血管病、神经系统疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病等的研究中。

基因治疗针对的疾病对象可以分为三个层次：病因、病变、病症。这种分类可以帮助我们设计和理解每个基因治疗方案的目标和设计方案。在这三个层次上都可以设计基因治疗的精准性方案。

■针对病因

针对病因进行基因治疗是最为理想的，也最能体现治疗的精准性。这方面的典型案例就是单基因遗传病。正是由于基因治疗为这些无药可治的遗传病提出了“一劳永逸”的治愈可能性，使得人们对它充满了期待。事实上，西方国家的基因治疗正是从单基因遗传病上取得突破的。年美国报道遗传性视网膜病黑矇症患儿获得治愈；血友病B基因治疗临床试验被报道取得巨大成功；先天性严重免疫缺陷患儿（“泡泡娃”）用基因治疗方法治愈；治疗脂蛋白脂酶缺乏症的基因治疗药物AAV1-LPL(SX，商品名：Glybera)年12月被EMA委员会推荐申请上市，成为西方世界第一个正式获批上市的基因治疗药物。这既是基因治疗历史上的重大事件，也是罕见病药物历史上的标志性事件。

■针对病变

虽然针对病因的治疗是我们追求的目标，然而由于疾病致病因素的复杂性以及病程演进导致的损害和功能障碍，在很多情况下不得不退而求其次地追求针对病变的治疗。大多数的疾病治疗都是针对病变进行的。比如肿瘤，它往往不是一个单一因素引起的，我们采取各种手段来消除发生肿瘤病变的组织并希望控制其转移和复发。十分有趣的是，基因治疗在针对病变的层面也开展了大量的工作并取得了显著成效。最为成功的例子当然是肿瘤的免疫细胞治疗如CAR-T疗法，从基因治疗的角度，CAR-T免疫细胞治疗就是一种exvivo转基因治疗，只是所转入的基因并不是经典的有治疗功效的基因，而是把转基因作为一种武装和教育T细胞的手段，其目标就是消灭有某种特殊标识的细胞。溶瘤病毒是另一种消灭某种病变细胞的策略，美国上市的T-Vec是一种携带了GM-CSF基因的改造的单纯疱疹病毒，自然也是一种针对病变的基因治疗。针对一些病因不明确的退行性病变而采用的营养因子（如NGF,BDNF,GDNF,IGF-1等）基因治疗也是这个方面的例子。

■针对病症

针对病症的治疗的目的是解除症状和危象，即使找不到病因或病变。在这个层面一般不需要或无法动用基因治疗。但是对于那些无法找到或处置病因病变的疾病，也有人在尝试用基因治疗。比如高血压、青光眼、帕金森氏病、疼痛等。这类疾病采用基因治疗的目的往往是由于其症状的长期性，药物治疗给病患因需要日常治疗而造成生活上极大的不便，希望能找到“一劳永逸”的治疗办法。但是，由于基因治疗还处于发展的早期，从法规上往往不容易通过针对那些已经有比较有效的现成药物或疗法的疾病、或发展很缓慢的慢性疾病的基因治疗方案。因此，这些基因治疗往往限于研究探索阶段。

三、基因治疗的原理设计

基因治疗的精准性从原理设计开始。

■基因替代或补偿

针对基因突变引起的疾病，通常的基因治疗策略是导入一个正常的基因来弥补，但并不处置突变的基因。往往把这种方式称为基因替代（genereplacement）或基因补偿（genesupplement）。基因替代和补偿主要用于隐性遗传病。将一个具有正常功能的基因及表达元件通过病毒载体或非病毒载体导入有因基因突变而导致功能异常的细胞中，或者导入到机体里其它部位，通过表达具有功能的蛋白分泌入血来补偿缺失的功能，由于技术手段的限制，目前开展临床试验的遗传病基因治疗大多数是针对单基因隐性遗传病。多数血友病的基因治疗就是这样的例子。对于致病基因是显性基因的显性遗传病，并不能通过导入一个正常基因来进行基因治疗，而是要补偿正常的基因功能的同时阻断致病基因的表达。

■基因阻断或下调

阻断或下调基因的表达是某些疾病基因治疗的重要策略。在慢性病毒感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等的基因治疗方案设计中都有采取这种策略的例子。基因阻断或下调的技术方法包括小干扰RNA（siRNA）、核酶（Ribozyme）、microRNA等在RNA水平的阻断或下调表达。而锌指酶、TALEN、CRISPR等基因编辑（geneediting）技术的出现，使人们可以直接“删改”基因，实现DNA水平的阻断。在蛋白水平的阻断则是通过导入可溶性受体、配体或抗体等阻断性蛋白基因来实现。

■基因纠正

突变或缺失基因的原位纠正，是自基因治疗概念产生以来就树立了的一种理想目标，是一种真正意义上的精准治疗。然而，虽然经过很多努力，对细胞内的突变基因进行原位修复或纠错仍旧效率极低。基因编辑技术尤其是CRISPR技术的出现使这种状况有了转机。人们对于把基因编辑技术用于遗传病的基因纠错寄予了很大的期望。尤其是一些显性遗传病，基因编辑技术可以实现定点切除突变基因，加上导入正确的基因片段进行修复，可望实现基因的原位纠错。在实验动物方面，通过基因编辑技术制造疾病模型尤其是单基因遗传病模型的效率也大大提高了。

■可调控表达的基因治疗

有些疾病的基因治疗需要基因的可调控表达。比较常用的小分子药物调控包括四环素调控、雷帕霉素调控等。miRNA的转录后调控也被应用到基因的时序表达设计中。近年来，光调控、磁调控的基因表达研究更使这个领域充满了神奇色彩。相信会有更多更好用的可调控基因表达的元件被发现和发明出来。安全可靠的可调控表达系统无疑是基因治疗技术中的重要环节，也是基因治疗朝向精准发展的重要体现。

■溶瘤病毒基因治疗

溶瘤病毒利用肿瘤细胞与正常细胞在某些基因表达和通路上的差异，对病毒基因进行改造，使其在正常细胞中不复制，只在肿瘤细胞中产毒性复制，从而杀死肿瘤细胞。在溶瘤病毒的基础上，再在其基因组中插入功能独特的外源基因和表达元件，构成一种增强型的溶瘤病毒，成为肿瘤基因治疗中的一种奇特策略。

四、从基因载体看基因治疗的精准性

事实上，基因载体系统的设计很大程度上是围绕精准性进行的。

■“弹头”精准

基因治疗的精准性首先体现在所选择的“治疗基因”的功能与疾病治疗之间的关系，也就是我们前一期说到的设计原理。这其中涉及到大量的基础研究，包括对基因功能、基因表型、基因调控机理、组织特异性等，以及对疾病的致病机理、分子诊断、进程和预后的认识。

■“力量“精准

主要是基因的表达精准，主要由基因表达元件的特性决定。其中涉及启动子的强度、组织特异性、表达的可调控性、调控因素和精确度、表达的稳定性和时序性、基因表达产物的分泌或分布、半衰期等。

■导入精准

人们希望治疗基因能靶向到人体内指定的器官和细胞中发挥作用，而不去身体其它的地方。我们把这个叫做导入的靶向性。然而，这在目前还很难，任何病毒载体和非病毒载体的导入靶向性都还无法达到”指哪打哪“的精准靶向，只能做到相对靶向。解决办法之一是采用组织特异性启动子，追求转录的靶向性。也就是说，即使载体把基因带到了其它地方，但只在需要的组织中才有效转录而发挥作用，在其它地方并不起作用。这种办法是一种退而求其次的选择，明显的缺点是往往只有少数载体到达了目标位置，大量的载体分散到了其它部位。且不说其引起无谓的免疫反应等副作用，这些去到其它地方的载体显然是一种浪费。

治疗基因和元件是核酸大分子，需要进入细胞内才能发挥作用。一般情况下，核酸大分子物质进入细胞的过程并不会像小分子药物一样自动被细胞摄取或被动扩散，它需要借助包裹在其外的导入材料（对病毒而言就是外壳或外膜，对于非病毒载体而言则往往是一些如脂质体、壳聚糖等高分子材料）才能完成进入细胞的过程。还不仅仅如此，进入细胞后，有些病毒载体携带的核酸借助其核壳粒通过一些独特的机制逃脱内吞体、溶酶体等的破坏、并运输到细胞核内发挥作用。这也是一种导入的精准性。

■给药精准

口服和静脉注射是最常用的给药方式。但对于基因治疗，这两种方式要么不能用，要么无法精准靶向。在导入不能完全精准的情况下，我们会借助给药方式和给药装置来实现给药精准的目的，也就是”指哪打哪“。比如肿瘤局部注射、颅内定点注射、视网膜下注射、肺吸入、膀胱灌注、导管介入等。

五、基因治疗是药物还是疗法

在谈到基因治疗（genetherapy）的时候，我们有时候会有些迷惑：基因治疗（genetherapeutics)是一种药物呢（基因药物），还是一种治疗方法（基因疗法）？

从遗传病的基因治疗来看，针对某种隐性遗传病可以采用基因替代治疗，即补充正常的功能基因。这种携带正常基因及表达元件的病毒载体或非病毒载体可以做成药物。目前，这类的治疗方案都是走药物申报的途径来实现临床应用和药品上市。很多携带细胞因子、自杀基因、干扰RNA的基因治疗以及溶瘤病毒，也都是以药物形式来申报注册。

然而，这种情况似乎不可类推和持续。考虑到目前至少有~种遗传病，它们虽然总数庞大，但其中大多数都是罕见病，即每一种病的病患数量都相对或绝对罕见；因此几乎不敢想像为每一种病研制一种药物。更为重要的是，当基因治疗设计原理日益向精准靠拢的时候，针对即使是同一个疾病比如血友病、地中海贫血、黏多糖病等，由于基因突变的位点或区间不一样，很难用同一种基因药物进行治疗纠正。

因此，从发展的眼光来看，基因治疗的发展方向将会是采用具有严格质量标准的转基因制品的治疗方法，而不是基因药物。目前的基因治疗以基因药物形式体现，是因为基因治疗还处于其发展早期，采取药物的规范来要求它，可以更严格地控制其生产工艺和质量标准，积累更多规范的临床试验经验。

五、基因药物是药物还是”分子机器“？

如果把基因治疗作为药物来看，这个药物与传统意义的药物，无论是小分子还是大分子都是很不同的。以治疗血友病B的重组腺相关病毒rAAV-FIX为例，它携带的并不是治疗血友病的凝血因子（FIX）蛋白，而是编码FIX蛋白的cDNA，以及调控它表达的基因元件；这些核酸物质通过AAV载体带入细胞中，借助细胞内的细胞器、酶类和各种机制，才产生有功能的蛋白分子并分泌到血液中，发挥凝血作用。因此，与其把它看做一种药物，不如认为它更像一台“分子机器”,或者称为“分子医疗机器人”。这样想来，就比较好理解基因药物是一种更为复杂的“药物”，它的体内代谢、生物分布、持续时间都与传统的药物不一样，因此，评价它的方法也会不一样。

一般把基因载体分成病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体是将外源基因和元件加载在病毒的基因组中，利用病毒进入细胞的天然嗜性将其带入细胞发挥作用。病毒颗粒直径大小在纳米范围内。非病毒载体则是将要导入的DNA或RNA用人工材料（一般是高分子材料或聚合体）包裹起来，做成纳米级颗粒，通过与细胞膜融合或被细胞摄取吞噬而将核酸带入细胞中。如果说病毒载体的生产用的是“上帝之手”，非病毒载体的制备则是人类模仿病毒载体组成和功能的学习过程，还有许多需要学习和改进的地方。

六、热点病毒载体

病毒的种类成百上千，而可应用的病毒载体种类却只有寥寥数种。可以看出把病毒改造成安全可靠而且实用的病毒载体系统并非易事。目前用于基因治疗临床实践和已经批准上市的热点病毒载体主要有4类：腺病毒载体、AAV载体、HSV1载体、慢病毒载体。它们之间并不是好和不好的差别，我们需要根据应用需求来选择合适的载体。

■AAV病毒载体

AAV病毒载体的优点有几条：首先它是一种不致病的病毒，因此安全性好；其次它在许多组织（肌肉、肝脏、视网膜、中枢神经等）中能介导外源基因等长期稳定表达，因此成为许多遗传病和慢性病的首选；第三是它的外壳有许多不同亚型和变种，使得AAV载体的“工具箱”里工具很丰富，针对不同组织可以采用不同组织嗜性的AAV载体；第四是AAV载体在细胞中以细胞核内染色体外不整合的附加子（episome）存在为主，只有不到2%的几率整合到染色体中，因此遗传毒性不明显；第五是它是一个很“干净”的载体，除了两段不编码任何蛋白和RNA的ITR之外，全部容量都可以用来装载外源基因和元件。因此它的“背景噪音”低。AAV载体的最大缺点是它因本身的基因组很小（5kb)而导致它的容量小，不能容载5kb以上的外源DNA。这使得非囊性纤维病变、血友病A、DMD等突变基因比较大的疾病的基因替代治疗用AAV载体装载很费劲或不可能。幸亏很多基因不是很大，适合于用AAV载体来做基因治疗。

■腺病毒载体

腺病毒载体是在早期基因治疗研究中应用比较多的一种病毒载体。目前应用的腺病毒载体大多还是Ad5型的，其它应用比较多的还有6，11，35等型。主要的基因组特点是是E1缺失和或E3缺失（第一、二代的腺病毒载体）。第三代腺病毒去掉来更多的病毒编码基因，有人称之为“gutlessvector”。这种腺病毒由于包装时需要野生型腺病毒或改造了的重组腺病毒作为辅助病毒，在纯化时很难去掉或很容易与载体基因组发生重组而产生出具有复制能力的腺病毒（RCA），从而对实验造成不利影响以及体内应用的安全隐患。腺病毒载体的特点是能介导外源基因的一过性高表达（体内往往是3-14天）。比较适合于作为肿瘤疫苗载体和传统方法不易研制的传染病疫苗载体（如埃博拉病毒）。腺病毒颗粒本身的免疫源性很强，这一点在其作为疫苗载体时刚好可起到免疫佐剂的作用。但在一些不希望有免疫应答反应的基因治疗设计中，这就是一个缺点了。

另外复制缺陷性的腺病毒载体对于转染体外培养的细胞也是一个不错的工具，只是对于有些细胞Ad5的转染效率不高，可以通过将其纤突蛋白的编码基因改换成其它型的如35型，变成Ad5F35型腺病毒载体，从而改变其细胞嗜性。Ad5的细胞受体是CAR，而Ad5F35的细胞受体是CD46。

5型腺病毒载体用于人体的一个比较大的缺陷是其先存免疫问题，即人群中大多数的人都因自然接触过5型腺病毒而在血液中存在抗Ad5的中和抗体和细胞免疫。这会明显影响Ad5载体的转染效率，也是它介导的体内基因表达时间比较短容易被清除的原因。

■单纯疱疹病毒载体

单纯疱疹病毒是一个基因组比较大的病毒（~kb），病毒编码的基因数量多（90个以上ORF，84个蛋白），其病毒基因表达的时序调控精巧而复杂，与宿主细胞的相互关系也很复杂，尤其是其在神经系统中的独特表现和潜伏与激活的机制，更使得这个病毒比较难以操作和驾驭。

1型单纯疱疹病毒(HSV1)作为载体应用得更普遍，虽然2型(HSV2)也有应用。单纯疱疹病毒载体主要有重组型和扩增子型两种。前者是在HSV1病毒基因组中加载外源基因及元件，而后者是基于质粒只保留HSV1病毒复制和包装所需的顺式作用元件，而将病毒复制包装所需要的所有功能都反式提供。

人群中90%以上人都感染过HSV1病毒并且中和抗体阳性。因此这个载体并不适合静脉注射，往往是瘤内注射或局部注射。

有趣的是，让单纯疱疹病毒载体“登堂入室”的是不久前溶瘤病毒T-Vec的成功上市。对于HSV1载体而言，T-Vec的上市使HSV1的安全性得到了认可，由此将带动HSV1病毒作为溶瘤病毒载体、疫苗载体和基因编辑载体的发展，预计下一个阶段会出现携带各种不同基因的HSV1病毒载体的设计和试验。

■慢病毒载体

慢病毒载体(lentiviralvector,LV)之所以引起人们的







































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