基因编辑技术的临床应用需要更精准的安全评

撰文丨杨辉团队

责编丨迦溆

近日南方科技大学贺建奎副教授宣称，其团队利用CRISPR技术对人类受精卵的CCR5基因进行了敲除，将这样的胚胎移入子宫并产生了一对基因编辑的婴儿，贺建奎宣称她们能够获得天然抵御艾滋病的免疫能力。在未经严格的伦理审查，在潜在脱靶现象和嵌合体现象无法得到很好的评估和改善的情况下贸然对人的胚胎进行基因编辑，还违反了年颁布的《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》规定对人体胚胎实施基因编辑和修饰不得超过14天的原则，甚至产下了基因编辑的婴儿，贺建奎团队的研究对生命科学领域造成非常严重的影响，引起社会各界的强烈反弹。为此，我们结合本实验室的研究经历同时，对此次事件的胚胎基因编辑技术本身做一个深入的讨论。

基因编辑效率及嵌合体问题

在贺建奎公布的数据中（PPT第38页），19个经过编辑的人类胚胎，只有7个胚胎中的CCR5基因完全被编辑，其中4个为纯合基因突变。然而剩余的12个胚胎中仍含有一定比例未被编辑的CCR5基因。换句话说，如果这些胚胎最终受孕出生，这些胎儿仍然能感染HIV病毒。由此可见，早期胚胎数据表明有超过60%的胚胎并未达到实验预期的效果，即获得免疫CCR5型的HIV病毒的婴儿。新出生的Nana也进一步证实了我们的担忧，她约一半的CCR5基因未被编辑。她即没有获得免疫HIV的能力，又经受了基因操作所带了的风险。

对于受精卵时期进行注射CRISPR的方式往往无法避免嵌合体现象，因为一细胞阶段注射CRISPR体系之后编辑的往往双倍体的基因组DNA已经进行了复制，无法保证所有拷贝都被进行了同样的敲除，也就是说并不能保证婴儿的全身所有细胞都被编辑。这就是发生所谓的嵌合体现象，嵌合体现象也是近年来科研工作者极力攻克的目标，年我们团队在CellResearch报道Cocktail的方法通过同时在一个基因上设计多个sgRNA的方法来减少F0代小鼠及猴中的嵌合现象，实现全身细胞的功能性敲除。出生的一对基因编辑婴儿如果CCR5基因未做到全身性的纯合敲除，就无法达到贺建奎团队想实现的目标。

图片引自：CellResearch

然而考虑到Cocktail方法需要用到多个sgRNA，这可能会增加CRISPR/Cas9脱靶的风险，而且近期许多研究报道，CRISPR/Cas9通过诱导DNA的双链断裂(DSB)来提高基因敲除和修复的效率的方式，有可能造成DNA大片段缺失或者插入，以及染色体异常（重审CRISPR的脱靶效应，NatureMethods发文全面分析基因编辑鼠的脱靶位点）。更何况这种技术只能适用于比较纯粹的基因敲除，对于更加精确的基因编辑，比如对于贺建奎这次原本计划的删除CCR5基因32个碱基的方案来说是不适合的。

为了尽最大可能消弭基因编辑带来的潜在风险，我们团队长年来一直致力于开发更加安全的基因编辑工具。年DavidLiu团队在Nature期刊上发表了单碱基编辑工具（BE3）首次实现可以在不引入DNA双链断裂的情况下对单碱基进行替换，我们设想这种不涉DNA双链断裂的点突变手段或许能够比传统方法更加高效而安全，能为单基因遗传病的治疗带来了新的希望。我们团队因此想利用单碱基编辑系统在人胚胎中进行高效的单碱基替换，研究人类早期胚胎发育过程以及用于修复单基因点突变的可能性。

在我们一项尚未发表的研究中发现单碱基系统在人的受精卵阶段部分位点的编辑效率依旧很低（20%）。我们认为这和人类胚胎(4-8细胞阶段)的合子基因激活(ZGA)的发生通常比小鼠胚胎(2细胞阶段)晚有关，为了解决这个问题，我们研究了在受精后不同时间点人类胚胎中单碱基编辑系统的效率。我们发现在胚胎发育的2细胞和4细胞时期注射，单碱基编辑系统BE3的编辑效率得到了显著的提高。不仅如此，在2细胞时期纯合编辑的卵裂球可以达到从受精卵注射的20%提高到80%。

然而，即便如此高的编辑效率，我们仍发现有一定比例胚胎仍含有未经基因编辑修复的卵裂球，如果贸然将类似的技术用于临床，诸如这样的胚胎发育成个体后仍有患病的可能。因此在将其应用到病人身上还需要进行更慎重的安全性评价和伦理学的讨论。

脱靶问题

从以往的经验来看，基因编辑的高效率往往会伴随高脱靶率的问题，我们在大幅提升BE3系统的编辑效率后便对其脱靶问题做了大量分析。我们首先借助于传统方法，也就是先用软件对sgRNA的潜在脱靶位点做出预测，然后对这些潜在脱靶位点进行测序分析。为了更进一步将基因编辑带来的突变与小鼠自身的基因突变区分开来，我们在两细胞时期对其中一个卵裂球注射BE3系统和指示的GFPmRNA，待卵裂球发育至8细胞时期研究人员通过荧光标签分离出编辑组和非编辑组的卵裂球通过全基因组扩增后进行全基因组测序。分析在CRISPR/Cas9所能够预测到的数万个off-target位均未检测到Off-target。结果在这些位点均未发现脱靶现象。

然而，尽管我们已经用了当时最高精度的脱靶分析检测，但这作为一项可能会用于临床的技术，我们依旧要问，这种程度的脱靶分析真的足够评估其风险吗？

无独有偶，在贺建奎公布的数据中（PPT第39页），针对19个经过编辑的人类胚胎，他们做了全基因组高通量测序（WGS）后也得出了没有脱靶的结论。

但如果仔细考虑这个问题的话，我们发现，由于胚胎细胞数比较少，做WGS之前，他们需要对每个胚胎的DNA进行全基因组体外预扩增。这一体外扩增处理，会额外引入许多突变，使得我们检测真实突变的难度增大。从WGS可以看出，数据未过滤前，每个胚胎含有几百万个indels（插入或缺失突变）。即便把遗传来源的indels过滤掉，也有几十万个。至于之后的一系列过滤方法，都存在一定的局限性和偏向性，无法排除这些脱靶是由于CRISPR/Cas9基因编辑导致的可能。所以，根据他目前公布的数据，完全不能说明CCR5的基因编辑是安全的，无脱靶的。而这也是现阶段绝大多数脱靶分析存在的问题。

因此我们认为有必要开发一种精度更高，可以区分突变来源并且不需要体外预扩增的全新脱靶分析技术。

而我们率先测试的目标，就是新开发的BE3单碱基编辑系统。

11月27日，我们和合作单位在生命科学预印本杂志BioRxiv在线提交了题为Baseeditinggeneratessubstantialoff-targetsinglenucleotidevariants的研究论文（