CRISPR最有诚意的基因编辑指南

现在，我们对CRISPR/CAS9基因编辑技术进行总结。

CRISPR/CAS9编辑系统已经从遥不可及，到现在已经是多数实验室的常备技能之一。啰嗦的话就不多说了，目前接触到并实际操作的用途有3个，一个是单基因靶向敲除，这个最常见；一个是用sgRNAlibrary进行全基因敲除，主要是用于受体的鉴定；还有一个是基因的定点插入。

背景介绍

CRISPR=ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats

成簇规律间隔的短回文重复序列。

palindromic是回文的意思。CAS9是一种核酸内切酶，现在也有其他类似的内切酶比如CAS12，CAF1等，酶切效率更高，脱靶效应更低。

年，日本人首先在大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中。

年，正式命名为成簇规律间隔的短回文重复序列。

年，科学家发现CRISPR的间隔序列与宿主菌染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过CRISPR系统以类似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遗传物质的入侵（这句话很拗口，意思是CRISPR可以编辑再次入侵的细菌或病毒，方式与RNAi类似）。

年，首次发现细菌可能利用CRSPR系统抵抗噬菌体入侵。

年，首次发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移。

年初，首次利用CRISPR/CAS9系统对人T细胞EMX1和PVALB基因以及小鼠Nero2A细胞Th基因实现了定点突变。

同年，Mali利用CRISPR/Cas9在人T细胞和K细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA修复机制高效介导外源基因定点插入。

因此，CRISPR/CAS9系统既可以定点敲除（实验室基因敲除），也可以精准插入（临床上治疗遗传病）。只不过稳转细胞系的方式目前比较成熟，所以，CRISPR/CAS9系统主要用于定点敲除。

应用前景

年8月17日，詹妮弗?杜德娜（JenniferDoudna）和埃玛纽埃尔?卡彭蒂耶（EmmanulleCharpentier）合作，在Science杂志发表论文，解析CRISPR/CAS9基因编辑技术的原理；年2月15日，张锋在Science杂志发表论文，首次将CRISPR/CAS9基因编辑技术应用于哺乳动物和人类细胞。由此，CRISPR/CAS9基因编辑的三大巨头诞生了——詹妮弗?杜德娜（JenniferDoudna）、埃玛纽埃尔?卡彭蒂耶（EmmanulleCharpentier）和张锋（FengZhang）。

三个团队的专利之争，也是赚足了眼球，一波未平一波又起。

他们分别创立了自己的公司，张锋率先创建EditasMedicine，詹妮弗?杜德娜（JenniferDoudna）创建IntelliaTherapeutics，埃玛纽埃尔?卡彭蒂耶（EmmanulleCharpentier）创立CRISPRTherapeutics，这三家公司均已上市。

如今三家公司均在CRISPR基因编辑治疗遗传病领域取得了许多突破，张锋的EditasMedicine已开始基因编辑治疗先天性黑蒙症10型的临床试验。卡彭蒂耶的CRISPRTherapeutics公司，在CRISPR基因编辑治疗β地中海贫血和镰状细胞病这两种罕见遗传病的临床试验中也取得了非常好的效果。

原理简介

Cas9/gRNA复合物在靶位点进行切割，产生双链断裂缺口（DSB:Double-strandbreak），细胞采用非同源末端连接（NHEJ:nonhomologousDNAendjoining）或同源重组（HDR:homology-directedrepair）的方式对断裂的双链进行修复，从而造成靶位点基因的插入/缺失突变。主要用途包括基因敲除/敲入、编辑病毒基因组等。

实验准备

[1]质粒：Cas9质粒，sgRNAlibrary质粒，慢病毒辅助质粒pMD2G,pSPAX2。

[2]待筛选细胞：生长状态良好的细胞，传代2~20之间，检测无支原体。

[3]其他准备：细胞培养相关试剂、细胞转染相关材料和试剂、分选相关试剂。

基因敲除（以敲除p53为例）

1.选择合适靶点，设计引物

[1]从NCBI下载兴趣基因DNA序列，在NCBI主页GENE界面输入“基因名称”、“物种”，搜索对应的基因。“homosapienstumorproteinp53”搜索。下拉至“Genomicregions,transcripts,andproducts”，可以看到转录本信息GenBankID（此ID与序列对应，可在核酸界面查询序列。

GenBankID命名规则如下：

NM,XM--编码类型转录本（NM为认证的，XM属于预测的）

NC,NG,AC等--基因组类型

NR,XR--非编码转录本（NR表示认证的，XR表示预测的）

AK,AF等命名--看注释，大部分为文章的作者提交的序列

[2]选择同源编码区外显子，点击GenBank，下载序列。用SnapGene软件打开序列，分析敲除位点。选择第一个同源区域segment，-，82bp；在sequence中查看，复制整个segment的碱基序列。靶点选择时，注意①必须在CDS区；②在独立外显子，尽量靠近蛋白N端（编码区前三分之一）；③不宜紧邻翻译起始密码子，避免翻译从下游ATG开始；④多个靶点之间序列不重叠，避免影响靶点有效性。

segment序列：atggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatg

[3]打开张锋实验室设计网站(