关于基因治疗,看看CNS的大牛们都做了哪

前言

随着基因编辑技术以及病毒载体工具的进一步优化，近年来基于基因编辑技术的治疗策略已在诸多疾病中取得了突破性进展[1-2]（如下图）。下面我们就根据疾病类型的分类（癌症、遗传罕见病、肝脏代谢类疾病等）来简单罗列下，近年来那些发表在CNS上的牛人在这些领域都取得了哪些突破性的成果！

图1：截止年基因治疗的临床试验适应症数目[2]

一

癌症免疫疗法

目前用于肿瘤的基因疗法主要是利用体外基因改造T细胞（CAR-T或TCR-T方式），让其具备攻击肿瘤细胞的能力，从而达到治疗肿瘤的目的（图2），现已在多种癌症的治疗中显示了令人振奋的治疗效果。

图2：工程化T细胞的制备与应用[3]

如下图工程改造T细胞的分类：TCR-T和CAR-T

图3：工程改造T细胞分类[2]

CARs赋予了基因修饰细胞（如T细胞）对肿瘤细胞表面靶抗原新的特异性。通常CARs是通过将抗体来源的单链可变片段连接到细胞内信号链（如TCR衍生的CD3ζ结构域）和一个或多个细胞内共刺激结构域而形成的。这种结构可以规避识别人类白细胞抗原（HLA）的需求，从而扩大了生理性T细胞的来源。而TCR工程化的T细胞则可以识别不在肿瘤细胞表面表达的细胞内抗原，主要是人类白细胞抗原。

目前基于CAR和TCR的细胞免疫疗法已在血液肿瘤中具有巨大的潜力，但其面临着一个重大问题就是细胞因子风暴。当这些工程化的T细胞靶向清除癌细胞的同时，大量产生的细胞因子也会对宿主的其他组织器官进行攻击，导致患者出现高烧、低压、休克甚至死亡。这些副作用通常与靶外效应或靶内、肿瘤外毒性有关。控制暴露时间和引入安全闭合开关可能会有效避免这些不良反应。虽然某些特定肿瘤的临床反应是突破性的，但需要更多的研究来更好地理解不良反应发生的机制，进而开发应对这些反应的最佳策略。近来通过基因编辑技术工程改造细胞策略的为细胞免疫疗法提供了新的思路（图4）。

图4：CAR-T细胞治疗的发展史[28]

UCAR-T：通用型CAR-T无需自体T细胞即可治疗淋巴瘤[4]

年2月来自美国华盛顿大学圣路易斯医学院的研究人员在Leukemia期刊上发文，他们通过CRISPR/Cas9移除了健康T细胞中的CD7和T细胞受体α链(TRAC)，获得了一种针对CD7+T细胞恶性肿瘤的抗自相残杀的UCAR-T(UCART7)。UCART7在体外和体内均表现出对人T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞系和原发性T-ALL的疗效，并且不会诱导异种GvHD。这项研究提出了一种不需要自体T细胞来治疗复发和难治性T-ALL和非霍奇金氏T细胞淋巴瘤的新策略。

SUPRACAR：一种分段的通用型可编程的CAR-T系统[5]

年4月Cell刊登了一篇来自MIT和波士顿大学研究人员的研究进展，传统的CAR-T疗法在针对不同癌症的治疗中需要再次重编程来切换靶标，这项研究开发出了一种升级版本的CAR-T细胞疗法-SUPRACAR。为了扩展靶向癌细胞的能力，他们构建了一套分段式通用型的可编程的癌细胞靶向杀伤系统。基于传统的CAR-T系统，他们进行了多个关键性的升级，首先在不重新设计癌细胞的情况下切换靶标的能力，微调调控T细胞程度可降低毒性，以及赋予对多种抗原的相应能力以对抗癌症的复发。使用SUPRA系统在两种不同的肿瘤模型中证实了其广泛的抗癌能力，通过人源化改造的系统可最大程度地降低潜在的免疫原性问题。同时该研究还扩展了一种正交的SUPRACAR系统来独立调节不同的T细胞亚群，证明这是一种双重诱导型的CAR系统。这些结果展示了通过合成生物学及可控性的工程化改造策略来优化CAR可显著提高细胞免疫疗法的安全性、有效性和灵活性。

图5：SUPPACAR[5]

IL-1拮抗剂：有望解决CAR-T细胞免疫疗法引起的细胞因子释放综合征和神经毒性[6]

目前利用CAR-T细胞治疗血液类癌症最大的风险来自细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性。此前由于缺少合适的动物模型因而对于这类风险的发生发展无法深入的理解，阻碍了预防及治疗策略的优化。年5月来自意医院-圣菲尔科学研究所创新免疫治疗组的研究团队在NatureMedicine发文，通过构建一种能表征CRS和神经毒性特征的小鼠模型，成功模拟了由CAR-T细胞介导的癌症清除引起的高烧和IL-6水平的升高（CRS标志性表型）。进一步的研究证实单核细胞是CRS中IL-1和IL-6的主要来源，因而采用减少单核细胞或阻断IL-6受体可明显预防CRS的发生。研究发现仅使用IL-6受体阻断剂并不能阻止神经毒性的发生，而IL-1受体拮抗剂不仅可以消除CRS，同时也可以阻止神经毒性的产生，显著延长患病小鼠的存活时间。这一结果为解决神经毒性提供了一种新的治疗策略，并为开发更加安全有效的CAR-T细胞治疗开辟了新的途径。

CD33敲除HSPCs：一种仅杀伤癌细胞的CAR-T细胞疗法[7]

年5月来自宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的研究人员在Cell期刊上报道了一种不会产生骨髓毒性的CAR-T细胞疗法，能有效治疗急性髓性白血病。他们通过CRISPR/Cas9技术敲除了健康造血干细胞的CD33，将CD33缺陷的HSPCs移植到体内可免于被CAR-T杀伤，并发挥正常的功能，从而实现了CAR-T仅杀伤癌细胞的可能。这一策略已成功在小鼠和猴子模型中得到证实，并在人类细胞中也显示出良好的效果。

CAR-T联合PD-1阻断进一步提高免疫抗癌效果[8]

年8月来自纽约纪念斯隆凯特琳癌症中心的SarwishRafiq研究团队在NatureBiotechnology发文，通过工程化T细胞表达PD-1抗体可显著提高抗肿瘤的活性。仅使用CAR-T治疗的肿瘤细胞可通过免疫检查位点效应产生免疫逃逸效应，而单纯使用PD-1阻断剂仅能增加自身的免疫抗癌效果，而将这两者联用则可互补各自的缺陷而增强抗肿瘤的效果。同时，这种联用还可显著降低PD-1阻断剂本身的毒副作用。通过构建针对CD19+和MUC16+肿瘤细胞的CAR-T细胞，发现在实体瘤和血液瘤的小鼠模型中，这两类新型CAR-T细胞在体内存留时间更长，疗效更好。这一新型的嵌合CAR-T细胞免疫疗法将为血液瘤乃至实体瘤的治愈创造更多的可能。

Tisagenlecleucel：复发或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤II期临床研究进展[9]

年12月StephenJ.Schuster研究团队在新英格兰医学杂志公布了一项利用Tisagenlecleucel开展的II期临床试验结果，评价了利用这种CAR-T细胞疗法治疗93名患有复发性或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的疗效和安全性。结果显示有52%的患者对这一疗法表现出积极效果，其中的40%的人完全缓解，12%的人部分缓解，这些结果表明使用tisagenlecleucel是一种有效的针对复发或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤的治疗手段。

细胞免疫治疗是当今癌症治疗领域最具应用价值的方向之一。为了扩大细胞免疫治疗有效的群体，联合免疫治疗将是未来肿瘤免疫治疗的最终趋势。唯有深入理解肿瘤免疫微环境和肿瘤的免疫逃避机制，才能合理的结合多种治疗方式（如免疫治疗、放化疗及靶向治疗），为晚期实体瘤患者的抗肿瘤治疗提供更为安全有效的治疗策略。

二

遗传罕见病治疗

全球已确认的罕见病大约有多种，但目前仅有几百种罕见病具有获批的治疗性药物。由于超过80%的遗传罕见病是由单基因缺陷引起的（资料来源：NIH），因而基因治疗在罕见病领域的意义显得尤为重要。对于罕见病，传统小分子药物通常是通过减轻症状而发挥作用的，与此相反，基因治疗拥有纠正基因缺陷的潜能，尤其对于单基因罕见病，提供了一个潜在的治愈方案，而不是瞬时的减轻症状。通俗来说，成功的基因治疗或许仅需一次治疗，而不需要终生的持续治疗。

目前基因治疗在罕见病治疗中的应用主要有以下几个方面：血液类疾病、肝脏代谢类疾病、眼科和神经遗传性疾病等。

1.血液类遗传疾病

基因治疗在血液类疾病中的治疗目前主要集中在β-血红蛋白缺乏症。这类疾病均是由于β-血红蛋白遗传缺陷导致的一类遗传性贫血症，是最常见的单基因遗传疾病，β地中海贫血和镰状细胞病(SCD)的患病率最高。鉴于HLA匹配的供体细胞不足，开发有效的基因治疗来纠正自体造血干细胞将是一个重大的突破，这将使全世界的患者受益。β-地中海贫血是由β-珠蛋白基因功能缺失突变引起的，导致溶血性贫血。根据其严重程度，该疾病分为轻度、中度或重度。重型β地中海贫血患者需要持续输血来治疗严重的贫血以及需要铁螯合剂进行辅助治疗以防止由此产生过量铁引起的副作用。相反，SCD是由氨基酸置换引起的，氨基酸替代产生了有缺陷的β-珠蛋白肽，而缺陷的β-珠蛋白肽又导致严重的镰状红细胞阻塞微血管并缩短半衰期。传统β-血红蛋白病基因治疗方式主要以慢病毒递送或电转的方式纠正自体造血干细胞的β-珠蛋白，进而回输到病人体内来进行的。而最新的研究发现通过重新激活成人γ-珠蛋白的表达可作为治疗β-血红蛋白病的新型靶点，这为β-血红蛋白缺乏症患者的治疗提供了新的思路。

Blood：利用靶向人类CD46的腺病毒载体首次实现CRISPR/Cas9在体内有效编辑HSPCs[10]

年6月来自华盛顿大学医学院的ChangLi等人在Blood期刊上发文，首次成功应用CRISPR/Cas9系统进行体内HSPC的基因编辑。由于涉及CD34+细胞红系分化的模型在评估γ-珠蛋白再活化方面存在局限，本研究建立了人β-珠蛋白转基因(β-YAC)小鼠，利用一种辅助依赖性的靶向人类CD46的腺病毒载体，将表达CRISPR/Cas9(HDAd-HBG-CRISPR)递送到小鼠体内来破坏γ-珠蛋白启动子内的抑制子结合区。一方面在在体外转导了来自β-YAC/人CD46转基因小鼠的HSPCs，随后将它们移植到辐照小鼠体内。另一方面，他们还同时使用了体内HSPC转导途径，包括HSPC动员和向β-YAC/CD46转基因小鼠静脉注射HDAd-HBG-CRISPR。两种方式均可有效地破坏γ-珠蛋白启动子内的抑制子结合区的靶位点，导致成年小鼠红细胞中人β-珠蛋白表达明显上调，在二次移植HSPCs后仍能维持表达。在随后长期的监测中，没有发现血液异常，这些结果表明HBG启动子编辑不会对造血产生负面影响。这是首个显示CRISPR/Cas9在体内成功编辑HSPC基因组的研究。

HRI:一种通过CRISPR/Cas9基因筛选得到的胎儿血红蛋白抑制剂，可作为镰刀型贫血症的潜在靶点[11]

年7医院和宾夕法尼亚大学的研究团队在Science期刊上发表研究论文，采用了一种基于蛋白激酶结构域的CRISPR/Cas9基因筛选平台，筛选出了一种能抑制红细胞血红蛋白翻译的特异性蛋白激酶HRI(也称EIF2AK1)，这是一种HbF抑制剂。HRI的缺失会以特定地方式显著增加HbF的表达，减少红细胞的镰刀型表征。研究发现HbF抑制元件BCL11A的表达减少很大程度上是HRI缺失引起的。这一发现为开发治疗镰刀型贫血症提供了新的潜在治疗靶点。

NatureMedicine：CRISPR/Cas9助力β-globin珠蛋白缺乏症[12]

年3月邦耀生物科学家吴宇轩研究员和哈佛大学医医院曾静研究员合作在NatureMedicine上发文，通过Cas9:sgRNA(RNP)介导+58BCL11A红细胞增强子的GATA1结合位点的切割导致该基序的高效破坏，从而引起BCL11A表达的减少，进而诱导了胎儿γ-珠蛋白的高表达。与此同时他们发现编辑效率高达80%的人CD34+细胞移植小鼠4个月后编辑效率大幅下降，这可能是由于CD34+细胞在对造血干细胞长期归巢和增殖起关键作用的长期造血干细胞（LT-HSCs）中的比例极低导致的，而LT-HSCs不易被Cas9进行编辑。基于此，他们优化了CRISPR基因编辑系统，进一步提高了体外CD34+细胞的基因编辑效率，高达98%。相对于微同源末端整合，对于编辑后的LT-HSCs更偏好于非同源末端整合（NHEJ）的修复方式。移植编辑后的镰刀状病人的HSCs的红系后代可表达治疗水平的HbF并抵抗镰状表型，而经基因编辑的β地中海贫血患者的红系后代也能恢复珠蛋白链的平衡。这项研究表明基于NHEJ方式进行BCL11A增强子的基因编辑可实现HSC中等位基因近乎完全的破坏是产生HbF持久表达的一种可行的治疗策略。

2.肝脏代谢类疾病

肝脏代谢类疾病是指因基因突变所引起的肝脏代谢障碍性疾病。目前基因治疗肝脏代谢类疾病主要围绕以下几种疾病：

1）血友病

血友病主要包括血友病A和血友病B，属于罕见的X染色体隐形遗传病，由于基因缺陷导致凝血因子VIII和凝血因子IX蛋白缺乏，引起机体凝血功能的异常，发生持续性出血，严重时还会影响生命。全球血友病联盟预测全球有超过15万人患有血友病A，接近3万人患有血友病B。目前，血友病是通过静脉输注凝血因子浓缩物来控制的，凝血因子浓缩物可以预防或治疗出血性事件，然而这一疗法需要持续性给药以及产生中和性抗体等因素限制了该方法的全面应用。肝导向基因治疗通常结合靶向肝细胞的AAV载体的使用来进行，作为蛋白质合成中心将转基因产物分泌到循环系统中。基因编辑技术的应用为血友病的精准修复提供了全新的治疗策略，为患者的终身治愈带来了可能。

图6：AAV基因治疗血友病发展史

CellReports：基因编辑重编程的自体细胞转分化为肝样细胞回输患者来治疗B型血友病[13]

年5月来自Salk研究所的研究人员在CellReports发文，首次利用自体皮肤细胞重编程为iPSCs后分别通过CRISPR/Cas9纠正突变的基因和定点整合F9cDNA两种方式，随后诱导分化成肝样细胞移植到血友病小鼠中，成功修复血友病表型，效果可持续一年之久。通过与正常人源肝细胞对比，基因编辑过的HLCs具有正常人源肝细胞同样的修复效果。对于血友病患者而言，利用其自身的细胞来产生健康的HLCs，随后再移植回患者体内，可有效避免患者出现的免疫排斥反应，为细胞治疗血友病提供了新的细胞来源。

JournalofControlledRelease:首次实现腺病毒作为CRISPR/Cas9介导的基因敲入平台来纠正B型血友病[14]

年3月来自华盛顿大学医学院的研究人员在JournalofControlledRelease上发文，首次使用腺病毒载体介导的基因编辑技术将mFIX定点整合到Rosa26安全位点，实现长期纠正出血表型的修复。尽管仍能检测到对腺病毒载体和Cas9核酸酶的适应性免疫反应，但产生的免疫反应并未抵消定点整合提供的治疗效果。总的来说，这项研究证明了腺病毒载体能够靶向基因整合且能长期校正幼年小鼠的遗传疾病。腺病毒载体具有较高的包装容量，有助于大片段基因的整合，也有助于精准的基因编辑策略。此外，腺病毒载体能够高效地进行细胞特异性感染，并且不容易整合到宿主基因组中。因此，使用腺病毒介导的基因递送并基于基因编辑的整合策略可以在降低遗传毒性风险的情况下完成疾病的校正，解决免疫反应抵消增益效果的问题将极大地推动腺病毒载体用于临床疾病治疗的应用。

2）α1-抗胰蛋白酶缺乏症（AATD）

α1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)是一种罕见的遗传代谢性疾病，主要表现为血清α1－抗胰蛋白酶(AAT)缺乏。可因AAT水平下降，无法抑制弹性蛋白酶活性，导致肺组织破坏，或因错误AAT蛋白在肝细胞内的积累导致肝损伤。AAT的补充治疗可以阻止或延缓患者肺组织的破坏，改善AATD预后，目前尚无特效疗法可以治愈此疾病。

传统的基因治疗通过引入致病基因的正确拷贝已被广泛用于预临床和临床治疗研究，随着时间的推移，减轻疾病的基因表达会逐渐丢失。目前的研究主要聚焦在基因纠正及基因的定点整合来持久地表达治疗性蛋白，展现了长期的治疗效果。

两项概念验证研究使用CRISPR-Cas9成功在α1-抗胰蛋白酶缺乏症（AATD）模式小鼠的肝脏中进行靶向基因校正，使低水平的正常AAT恢复到正常水平[15-16]

年3月来自美国马萨诸塞大学、中国同济大学和武汉大学的研究人员在HumanGeneTherapy上发文，证明了AAV递送CRISPR/Cas9系统能够有效地纠正AAT缺乏小鼠模型肝脏中的Z-AAT突变。具体而言，我们共注射了两种AAV：一种表达Cas9，另一种编码AAT导向核糖核酸和同源性依赖修复模板。在新生小鼠和成年小鼠中，这种治疗部分恢复了血清中的甲氨蝶呤。此外，深度测序证实了肝脏中的indel突变和精确的基因校正，允许仔细分析体内的基因编辑事件。本研究证明了CRISPR-Cas9技术应用于校正体内AAT突变的概念性验证，为此类疾病的治疗提供了新的依据。

年6月来自美国Editas医药公司和圣路易斯大学医学院的研究人员在HumanGeneTherapy上发文，通过两种CRISPR/Cas9基因编辑策略分别降低PiZ转基因小鼠AAT-M的肝脏累积以及增加系统中AAT-M水平，纠正了小鼠的疾病表型。α1抗胰蛋白酶缺乏症是由SERPINA1基因突变引起的遗传性肝病。大多数重症患者会存在PiZ（氨基酸EK）等位基因的纯合子突变，这会导致肝细胞中的AAT-M的聚集和系统中AAT循环水平的降低。肝脏AAT-M的聚集通常会导致纤维化、肝硬化和肝细胞癌，而循环AAT水平的降低则会导致肺气肿和慢性阻塞性肺疾病。在本研究中，通过两种AAV8-CRISPR递送的靶向策略分别靶向hSERPINA1的2号外显子来敲低有毒性的突变AAT表达以及双载体系统纠正Z突变（EK），从而降低了98%的肝细胞中有毒突变性AAT-M水平和纠正了4-5%的Z突变。这项研究表明CRISPR基因编辑可有效降低AAT-Z的肝脏表达，并在AATD小鼠模型中恢复适度水平的野生型AAT-M，证实了CRISPR基因编辑在治疗AATD的可行性。

GeneTherapy：通过CRISPR/Cas9靶向Rosa26安全位点定点整合α1-抗胰蛋白酶基因治疗α1-抗胰蛋白酶缺乏症[17]

年4月25日来自美国华盛顿大学圣路易斯医学院的研究人员在GeneTherapy期刊上发文，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术结合腺病毒载体递送人α1-抗胰蛋白酶基因定点整合到小鼠肝脏中的Rosa26安全位点，基因的表达可持续天之久。此外，基因敲入保持了比游离表达更高的血清蛋白水平。这种方法还可以进一步推广到其他血清蛋白，并支持体内cDNA替换以实现稳定的基因表达。

3）遗传性I型酪胺酸血症

遗传性I型酪胺酸血症（hereditarytyrosinemiatypeI,HT1）是一种肝脏遗传病，主要是由于延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)基因的一个A→G点突变导致。HT1病人需要遵从严格的饮食要求和接受尼替西农（nitisinone,NTBC）的治疗。如果治疗失败，患者会出现肝功能衰竭和肝癌。

产前基因编辑治疗出生前后致死的遗传类疾病[18]

子宫内基因编辑有可能在产前治疗一类出生前后不久就会致病或死亡的遗传疾病。年10月医院和宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的研究人员在NatureMedicine发文，首次进行子宫内基因编辑来阻止疾病动物出现致命性的代谢障碍，为出生前治疗人类先天性疾病提供了新的治疗依据。该研究利用腺病毒载体递送CRISPR/Cas9系统和三代碱基编辑器（BE3）通过子宫内注射的方式分别成功纠正了PCSK9的功能性缺失突变来降低胆固醇的水平，以及靶向酪氨酸上游的Hpd产生无义突变实现基因的敲除阻止毒副产物的累积而挽救HT1的致死表型。这项研究概念性地验证了出生前有效进行基因编辑治疗遗传疾病的可行性，为某些先天性遗传疾病提出了一种新型潜在的治疗方法。

首次利用腺嘌呤碱基编辑器成功治疗酪氨酸血症[19]

年2月来自麻省大学的WenXue课题组、武汉大学的HaoYin课题组和Broad研究所DavidLiu课题组合作在NatureBiomedicalEngineering上刊文，使用基于CRISPR系统的碱基编辑器，首次成功地在成体小鼠模型中治疗了由于G＞A基因突变导致的酪氨酸血症。与传统的CRISPR/Cas9同源介导的修复不同，单碱基编辑系统无需提供修复模板就可以纠正点突变。该研究利用一种腺嘌呤碱基编辑系统（ABEs）和nCas9-sgRNA的质粒系统通过流体动力学尾静脉注射的方式成功纠正了酪氨酸血症小鼠中八号外显子C端的AG剪切位点突变。ABE治疗部分恢复了FAH蛋白的剪接，在肝脏中产生了FAH?肝细胞，恢复了小鼠的体重下降。同时研究人员还利用脂质纳米粒来递送化学修饰的sgRNA和密码子优化的ABEsmRNA，在肝脏中产生FAH?肝细胞，结果表明比标准ABEs具有更高的碱基编辑效率。这一发现表明腺嘌呤碱基编辑系统可以用于校正成年动物的遗传疾病。

4)苯丙酮尿症

苯丙酮尿症是一种由编码苯丙氨酸羟化酶的基因发生突变的可遗传性氨基酸代谢缺陷疾病。这种由肝细胞产生的酶代谢苯丙氨酸。患者肝脏中缺乏苯丙氨酸羟化酶（PAH），使得食物中的苯丙氨酸无法转化为酪氨酸，结果导致大脑内苯丙氨酸聚集，经转氨酶的作用转化为苯丙酮酸，从而影响患者的大脑发育，引起智力障碍和癫痫，并使患者出现皮肤白化、头发变黄、尿液有鼠臭味等症状。到目前为止，这种疾病仍然是无法治愈的。

利用新型碱基编辑器体内基因治疗苯丙酮尿症[20]

年10月在一项新的研究中，来自瑞士苏黎世联邦理工学院和苏黎世大学的研究人员在NatureMedicine发文，使用AAV递送分段的单碱基编辑系统CBEs成功校正了苯丙酮尿症(PKU)小鼠的疾病表型。研究人员使用了一种整合-分裂的碱基编辑系统，允许CBEs蛋白分裂成两个部分，从而绕过AAV载体有限的装载容量限制。通过静脉注射到PKU小鼠体内，纠正了PAH的活性，成功将苯丙氨酸水平将至nmol/L以下。这项研究证实利用AAV介导的分段单碱基编辑系统在体内治疗遗传疾病的策略是可行的，显示了潜在的临床应用价值。

3.眼科领域的应用

Leber’s先天性黑矇(Lebercongenitalamaurosis,LCA），是发生最早、最严重的遗传性视网膜病变,出生时或出生后一年内双眼锥杆细胞功能完全丧失，导致婴幼儿先天性盲。LCA占遗传性视网膜病变的5%以上，是导致儿童先天性盲的主要疾病（占10%-20%）。多呈常染色体隐性遗传，目前已发现有多个基因突变导致的不同类型先天性黑蒙症。

LUXTURNA：首个被美国FDA批准的针对遗传病的基因疗法[21]

年12月10日，FDA批准了Spark公司AAV基因疗法LUXTURNA，通过AAV病毒载体，将正确的RPE65基因递送到视网膜细胞，用于治疗双等位基因RPE65突变相关Leber’s先天性黑蒙2型患者，这是美国批准的首个针对遗传病的基因疗法，该疗法售价高达85万美元/年。由于RPE65是常染色体隐性突变，早期基因治疗的成功为其他遗传性视网膜营养不良症提供了经验指导。目前正在使用AAV载体对Leber遗传性视神经病变(NCT、NCT)、脉络膜炎(NCT、NCT)、X连锁视网膜分裂(NCT、NCT)、X连锁色素性视网膜炎(NCT)和色盲(NCT、NCT)进行临床试验。

EDIT-：利用CRISPR基因编辑工具成功治愈10型先天性黑蒙症，并获得FDA批准用于临床试验[22]

年1月来自EditasMedicine公司的MorganL.Maeder等人在NatureMedicine发文，开发了一种候选基因组编辑治疗工具EDIT-，用于去除由CEP基因中IVS26突变（位于26号内含子c.+A＞G的突变，其突变产生新的剪接供体位点，导致转录提前终止）产生的异常剪接供体，恢复CEP的正常表达。先天性黑蒙症10型是一种由CEP基因突变引起的严重视网膜营养不良，由于CEP基因的编码序列过长（~7.5kb），目前无法通过AAV载体递送正确编码的CEP基因来进行治疗。为克服这一难题，研究人员开发了一种特异性CEPIVS26突变的基因编辑策略，通过两对gRNA分别靶向IVS26突变区域的上下游，直接将突变内含子区域整体删除或倒位，从而恢复CEP基因的正常表达。这一方法巧妙地避开了AAV包装上限的问题，为同一类型的遗传疾病的治疗提供了新的思路。EDIT-已被FDA批准用于临床试验，有望成为世界上第一款在人体内使用的CRISPR疗法。

4.神经遗传性疾病

杜氏肌营养不良(Duchennemusculardystrophy,DMD)是由于抗肌萎缩蛋白基因（dystrophin，肌细胞中的骨架蛋白）突变所致的X连锁隐性遗传病（突变导致的抗肌萎缩蛋白功能缺失所致），主要发生于男孩（发病率为1/~1/）。目前DMD主要通过使用糖皮质激素类药物来治疗，但还无法根治。通过基因编辑则有可能治愈这类疾病，前期的研究报道已经通过使用CRISPR/Cas9系统有效改善了DMD疾病的治疗效果，但未进行长期地疗效跟踪，无法确定其安全性和持久性。

SciAdv：利用CRISPR/Cas9破坏DMD突变“热点”区域剪接位点的方式纠正DMD的表达[23]

年1月30日来自德克萨斯大学西南医学中心的研究人员在SciAdv发文，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功地利用同源性定向修复法(HDR)修复了肌营养不良症小鼠(md小鼠)的生殖系统及肌肉干细胞中的DMD点突变，并通过末端连接(MMEJ)方式修复了该小鼠的肌肉组织，最终显著改善小鼠的肌营养不良症状。DMD目前已知的突变接近多种，一个显而易见的问题就是如何通过CRISPR/Cas9基因编辑来纠正如此大量的突变。研究发现这些突变大都聚集在该基因的“热点”区域(外显子45-55和外显子2-10)，若能跳过“热点”内或附近的12个目标外显子中的1到2个(称为“前12个外显子”)理论上可以挽救大多数DMD患者的肌营养不良蛋白功能(约60%)。在这里，该研究利用CRISPR/Cas9系统去破坏DMD突变位点前的保守剪接受体或供体位点来绕过突变或编码框以外的外显子，从而通过周围外显子之间的剪接来重建不含突变区域的编码框内功能DMD的表达。这一研究有望为基因编辑消除遗传因素相关的肌肉和心脏异常提供新的方法。

ABEs:首次使用腺嘌呤碱基编辑器实现杜氏肌营养不良症的修复[24]

年7月来自韩国首尔国立大学Kim研究组在Naturebiotechnology上发文，首次使用反式剪接的腺相关病毒载体将分段的ABE基因递送到杜氏肌营养不良小鼠模型的肌肉细胞中，以纠正Dmd基因中的无意义突变，证明了碱基编辑在成年动物中的治疗潜力，具有巨大的临床应用价值。

NatureMedicine：注射AAV-CRISPR到新生小鼠可长期有效治疗杜氏肌营养不良症[25]

年2月美国杜克大学生物医学工程系的CharlesA.Gersbach团队在NatureMedicine上发文，通过单次静脉注射编码CRISPR(AAV-CRISPR)的腺相关病毒可长期恢复杜氏肌营养不良小鼠的疾病表型，并且证明AAV-CRISPR在新生小鼠体内不会产生体液和细胞免疫反应。研究还意外地发现AAV载体有整合进DMD和其他基因组区域的风险，说明通过AAV-CRISPR基因治疗策略仍需等待进一步安全性的评估。总的来说，这一研究从AAV-CRISPR治疗DMD的持久性和安全性角度证明了AAV-CRISPR基因治疗的可行性，提供了一种避免机体免疫应答的给药方法。

三

基因治疗在其他疾病领域的应用

早年衰老综合症（Hutchinson–Gilfordprogeriasyndrome，HGPS）

核纤层蛋白病变是由于核层蛋白的突变引起的退化性疾病。最严重的形式表现为与多种组织和器官的过早退化相关的器官加速老化。因此，这些疾病为鉴定衰老相关的分子机制提供了研究的平台。HGPS是这类疾病最严重的形式之一，发病早，进展快，致死率高。它在出生后不久就被诊断出来，死亡的平均年龄为14.6岁。目前尚无治愈方法，现有的治疗旨在缓解相关的症状。

尽管法尼基转移酶抑制剂对该病有改善效果，目前正在临床试验中，但由于这些抑制剂对其他CaaX蛋白底物的潜在副作用，以及非法尼基progerin的作用尚不清楚，因此现有的疗法仍存在局限性。大多数患者(80-90%)是由LMNA基因(编码laminsA和C)中的一个新的点突变引起的，它激活了外显子11中的一个隐秘的剪接位点(c.CT;p.GlyGly)，导致早衰蛋白progerin的表达，progerin是一种截短的laminA变体（缺失50个氨基酸），仍保持法尼基化，导致核包膜形态的改变以及细胞功能受损。通过在小鼠中诱导相应的突变(GlyGly)可诱导与人类患者相似的表型。层粘连蛋白A似乎是可有可无的，这可能是由于其较短的同种型层粘连蛋白C14，15的补偿作用，而没有层粘连蛋白A的小鼠比野生型小鼠活得更长，这表明HGPS不是由于层粘连蛋白A的缺乏，而是由于progerin的积累。因此HGPS可以通过CRISPR/Cas9靶向破坏laminA/progerin来治疗。

NatureMedicine：两项突破性研究利用CRISPR/Cas9系统成功改善早衰小鼠的衰老表型[26-27]

年2月来自西班牙奥维耶多大学的CarlosLópez-Otín和JoséM.P.Freije团队和美国Salk生物研究所的Beyret团队同时在NatureMedicine上发文，通过CRISPR/Cas9基因编辑系统降低progerin蛋白的表达，显著改善了HGPS小鼠的衰老表型。Carlos团队通过慢病毒递送双靶点的CRISPR/Cas9系统，在不影响laminC的前提下有效地降低了小鼠和人早老症成纤维细胞laminA和progerin的表达，恢复了核型。随后他们以腹腔给药的方式通过AAV9递送CRISPR系统到HGPS小鼠中，虽然编辑效率较低，但获得了有效的表型改善和寿命延长。而Beyret团队同样展示了通过单剂量面部静脉注射腺相关病毒递送CRISPR-Cas9组分来降低laminA/progerin，结果也显示能显著改善HGPS小鼠的疾病表型。这两项独立的研究是互补的，揭示了CRISPR/Cas9在人类HGPS患者治疗中的潜在用途。这些研究显示了在早衰小鼠模型中基因组编辑的临床前功效，并为HGPS和其他目前无法治愈的系统性疾病通过使用CRISPR/Cas9进行基因治疗铺平了道路。

总结和未来展望

纵观50年基因治疗发展的历史，基因治疗的发展必须基于其在临床治疗方面的应用，因此努力提高基因治疗的安全性和有效性是当前基因治疗发展的重中之重。随着越来越多的基因治疗药物的获批上市，基因治疗无疑会推动整个医药产业的巨大发展。在全球巨大的医疗需求和治愈重大疾病潜力的驱动下，基因治疗药物的研究合作将走向医疗机构与药物企业合作的模式，由此将带来巨大的经济效益和社会效益。目前，在新兴技术的驱动下，国际上已经出现了以CRISPR/Cas9技术为核心的三大基因编辑公司：EditasMedicine,CRISPRTherapeutics和IntelliaTherapeutics。这三大基因编辑公司均致力于重大遗传疾病和肿瘤的基因治疗药物的研发，旨在攻克一系列人类重大疾病。我国基因治疗领域已逐渐从不规范的细胞治疗行业的乱象正慢慢走入正轨，目前多家生物科技公司，南京传奇、科济生物、优卡迪、邦耀生物等逐渐已走上正规化的阶段。目前国内最为