连发两篇Science,中国科学家ld

中国科学家发表两篇Science论文，对多种基因编辑工具进行“测评”。两项研究都指出，被学界看好的单碱基编辑工具有着极高的脱靶风险，其中一项还提出了全新的脱靶率检测技术“GOTI”。

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撰文戚译引

CRISPR基因编辑技术已经发展出多种形式，然而它们都隐含着同样的风险，那就是脱靶（off-target）——意外编辑了基因组中其他的基因，造成不可预测的后果。在去年底引发巨大争议的贺建奎事件中，许多科学家就表达了同样的担忧：这次编辑究竟有没有发生脱靶？你怎么证明没有脱靶？

学术界早就意识到脱靶问题的存在，但量化评估十分困难。3月1日，中国科学家为主的两个团队在Science发表论文，每篇论文只有两页，却揭示了同一个重要的信息：基因编辑有风险，其中单碱基编辑系统（baseeditor）脱靶尤其严重。

什么是单碱基编辑？

单碱基编辑技术由CRISPR-Cas9改进而来。CRISPR技术的基本原理，就是用RNA引导Cas9等核酸内切酶对DNA上的目标区域进行编辑，可以删除或激活目标基因。核酸内切酶有许多种，Cas9是其中最早被发现、应用最广泛的，此后被发现的酶还有Cpf1、Cas12b、Cas13等。

Cas9同时对DNA的双链进行剪切，形成双链断裂（doublestrandbreaks，DSBs），修复的过程中容易产生新的突变。而单碱基编辑器对Cas9进行了改进，并添加了脱氨酶（deaminase），只对DNA的一条链进行切割，然后精确地对一个碱基进行修改。

根据目标碱基的不同，单碱基编辑工具可分成两类，一类是胞嘧啶单碱基编辑器（cytidinebaseeditor，CBE），将胞嘧啶（C）转换成胸腺嘧啶（T）；另一类是腺嘌呤碱基编辑器（adeninebaseeditor，ABE），将腺嘌呤（A）转换成鸟嘌呤（G）。

单碱基编辑看起来操作更精确，因而被寄予厚望。但这次的两篇Science论文对不同编辑技术的脱靶率进行了评估，发现胞嘧啶单碱基编辑器具有极高的风险。

全基因组范围的脱靶效应

中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队用水稻进行实验，发现CBE会引发全基因组范围的脱靶效应，其引发的突变数量大约是自然环境下发生突变的两倍（DOI:10./science.aaw）。

高彩霞团队论文。

高彩霞团队借助全基因组测序技术，对三种应用广泛的单碱基编辑工具BE3、高保真BE1（HF1-BE3）和ABE进行了检验，前两者为。与野生型对照组和ABE相比，BE3和HF1-BE3（均属于CBE）引发了数量显著更多的单核苷酸变异（singlenucleotidevariant，SNV），主要是将基因组中其他部位的胞嘧啶也变成了胸腺嘧啶。

研究还发现，脱靶预测算法Cas-OFFinder预测并不准确。在接受BE3编辑的植株中，只有6处突变发生在预测的3个突变部位中；而在接受HF1-BE3和ABE编辑的植株中，没有一处突变发生在预测的部位中。

GOTI：评估脱靶的新方法

中国科学院神经科学研究所杨辉团队和斯坦福大学LarsM.Steinmetz团队合作的研究也得出了相似的结论：Cas9和ABE引发的单核苷酸变异较少，而CBE让突变的数量翻了20倍（DOI:10./science.aav）。

杨辉团队论文。

该研究的另一亮点在于提出了全新的脱靶评估技术GOTI（Genome-wideOff-targetanalysisbyTwo-cellembryoInjection）：在小鼠胚胎卵裂球的二细胞期，对其中一个细胞进行基因编辑，并进行荧光蛋白tdTomato标记；随后，在胚胎发育的第14.5天用流式细胞仪（FACS）将两个细胞的子代进行分离，分别进行测序。

借助GOTI技术，科学家第一次能够对脱靶进行全面的量化评估。杨辉团队对CRISPR-Cas9、BE3和ABE7.10进行了检验，全部12组中发生的插入/缺失（indel）数量在0到4之间，并且没有一个发生在预测的脱靶部位。

实验发现，在经过BE3编辑的胚胎中平均发生个SNV；相比之下，经过ABE7.0编辑的胚胎平均发生10个SNV，与自然突变的数量无显著差异。而且，BE3编辑引发的一些突变发生在原癌基因或抑癌基因上，这进一步提示了可能的致癌风险。

临床应用要谨慎

Science采访了业内人士对此的看法。哈佛大学化学家、第一代碱基编辑器的发明者刘如谦（DavidLiu）认为，基因编辑的错误整体上仍属罕见，不太可能对实验室应用造成影响，但足以为那些想要在病人身上进行试验的人敲响警钟。

Cas-OFFinder的发明者、来自韩国国立首尔大学（SeoulNationalUniversity）的Jin-SooKim说：“这两篇论文很有趣，也很重要。现在重要的是找出是哪一种成分引发了其他突变，以及如何减少或消除它。”医院（MassachusettsGeneralHospital）病理学家、刘如谦的合作伙伴J.KeithJoung认为，对编辑器中的脱氨酶或其他成分进行改进或许能够减少脱靶效应。

基因编辑疗法被寄予厚望。在治疗镰刀形红细胞贫血症、莱伯先天性黑蒙症方面，相关治疗手段已进入临床试验阶段。而这两项研究进一步提示了基因编辑技术可能存在的风险，再次说明了在投入临床应用前进行充分安全性评估的必要性。

论文信息

Cytosine,butnotadenine,baseeditorsinducegenome-wideoff-targetmutationsinrice

ShuaiJin,YuanZong,QiangGao,ZixuZhu,YanpengWang,PengQin,ChengzhiLiang,DaowenWang,Jin-LongQiu,FengZhang,CaixiaGao

Science

28Feb

10./science.aaw

Cytosineandadeninebaseeditors(CBEsandABEs)arepromisingnewtoolsforachievingtheprecisegeneticchangesrequiredfordiseasetreatmentandtraitimprovement.However,genome-wideandunbiasedanalysesoftheiroff-targeteffectsinvivoarestilllacking.Ourwholegenomesequencing(WGS)analysisofriceplantstreatedwithBE3,high-fidelityBE3(HF1-BE3),orABErevealedthatBE3andHF1-BE3,butnotABE,inducesubstantialgenome-wideoff-targetmutations,whicharemostlytheC→Ttypeofsinglenucleotidevariants(SNVs)andappeartobeenrichedingenicregions.Notably,treatmentofricewithBE3orHF1-BE3intheabsenceofsingle-guideRNAalsoresultsintheriseofgenome-wideSNVs.Thus,thebaseeditingunitofBE3orHF1-BE3needstobeoptimizedinordertoattainhighfidelity.